Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease.
PBN-AR
Instytucja
Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie
Informacje podstawowe
Główny język publikacji
angielski
Czasopismo
JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY
ISSN
0022-2836
EISSN
Wydawca
ACADEMIC PRESS LTD- ELSEVIER SCIENCE LTD
DOI
URL
Rok publikacji
2019
Numer zeszytu
11
Strony od-do
2082-2094
Numer tomu
431
Identyfikator DOI
Liczba arkuszy
Słowa kluczowe
angielski
crystal structure;
directed evolution;
in vitro compartmentalization;
restriction endonuclease;
specificity engineering
Open access
Tryb otwartego dostępu
Inne
Wersja tekstu w otwartym dostępie
Wersja opublikowana
Licencja otwartego dostępu
Creative Commons — Uznanie autorstwa-Niekomercyjne-Bez utworów zależnych
Czas opublikowania w otwartym dostępie
Przed publikacją
Data udostępnienia w sposób otwarty
Streszczenia
Język
angielski
Treść
Specificity engineering is challenging and particularly difficult for enzymes that have the catalytic machinery and specificity determinants in close proximity. Restriction endonucleases have been used as a paradigm for protein engineering, but successful cases are rare. Here, we present the results of a directed evolution approach to the engineering of a dimeric, blunt end cutting restriction enzyme NlaIV (GGN/NCC). Based on the remote similarity to EcoRV endonuclease, regions for random mutagenesis and in vitro evolution were chosen. The obtained variants cleaved target sites with an up to 100-fold kcat/KM preference for AT or TA (GGW/WCC) over GC or CG (GGS/SCC) in the central dinucleotide step, compared to the only ~17-fold preference of the wild-type enzyme. To understand the basis of the increased specificity, we determined the crystal structure of NlaIV. Despite the presence of DNA in the crystallization mix, the enzyme crystallized in the free form. We therefore constructed a computational model of the NlaIV-DNA complex. According to the model, the mutagenesis of the regions that were in the proximity of DNA did not lead to the desired specificity change, which was instead conveyed in an indirect manner by substitutions in the more distant regions.
Inne
System-identifier
PX-5d694177d5dede53d23fecea
CrossrefMetadata from Crossref logo
Cytowania
Liczba prac cytujących tę pracę
Brak danych
Referencje
Liczba prac cytowanych przez tę pracę
Brak danych